同样的主题，又一篇10+Cell子刊！看看矛盾的结果怎么用，才能让研究层次提升！

来源：市场资讯

（来源：小张聊科研）

今天介绍的发表在《Cell Reports Medicine》上的研究也是这个模式的一种：“Targeting the noncanonical function of metabolic enzyme PHGDH in driving PD-L1 expression and cancer immune evasion”，即：靶向代谢酶PHGDH的非经典功能，驱动PD-L1表达与癌症免疫逃逸。

研究主要发现：PHGDH除了经典的丝氨酸合成代谢功能外，还能通过结合RAF1并解除14-3-3对RAF1的抑制，激活MEK/ERK信号通路，从而上调PD-L1表达，帮助肿瘤细胞逃避CD8⁺ T细胞的杀伤。肿瘤中PHGDH高表达者对PD-1/PD-L1阻断疗法更敏感，而联合PHGDH酶活性抑制剂与免疫检查点阻断，能产生显著的协同抗肿瘤效应。

从临床疑问到机制解码：一段层层深入的探索之旅

起点：PHGDH缺失为何在免疫健全小鼠中抑瘤更明显？

研究团队最初的兴趣源于一个反常现象：PHGDH（磷酸甘油酸脱氢酶）是丝氨酸合成通路限速酶，在多种癌症中高表达且与不良预后相关。作者在MC38和CT26结直肠癌细胞中利用CRISPR-Cas9构建了PHGDH敲除（KO）细胞，分别植入免疫健全小鼠（C57BL/6，BALB/c）和免疫缺陷裸鼠中（Figure 1B-1D）。结果发现，PHGDH KO在免疫健全小鼠中引起的肿瘤生长抑制程度远大于在裸鼠中的抑制程度，这强烈提示：PHGDH除了促进肿瘤增殖，可能还参与调控抗肿瘤免疫。进一步流式分析显示，PHGDH KO肿瘤中CD8⁺ T细胞浸润增多，且产生颗粒酶B和IFNγ的能力增强（Figures S1, S2A-C）。这一现象使研究者猜测：PHGDH可能通过影响免疫检查点来介导免疫逃逸。

关键发现：PHGDH上调PD-L1，且不依赖其酶活性

为了验证上述假设，作者检测了多种癌细胞中PHGDH与PD-L1的关系。Western blot与qPCR结果显示，PHGDH KO显著降低PD-L1蛋白和mRNA水平（Figure 2B, 2C, S3A-B），而回补野生型PHGDH则可恢复PD-L1表达。更有趣的是，当研究者引入两种酶活性失活的PHGDH突变体（D175N和R236K）时，它们依然能完全恢复PD-L1表达（Figure 2A-2C），这说明PHGDH上调PD-L1不依赖于其丝氨酸合成功能。为了进一步确认，他们使用两种特异性PHGDH酶活性抑制剂NCT-503和CBR-5884，发现即使高浓度抑制酶活性，也无法改变PD-L1的蛋白或mRNA水平（Figure 2F-2I）。这些结果让研究者确信：PHGDH存在一个独立于代谢的全新“非经典功能”——驱动PD-L1表达。

分子机制探索：谁是PHGDH的结合伙伴？

为寻找PHGDH上调PD-L1的直接机制，团队采用免疫共沉淀联合LC-MS/MS蛋白质组学，在RKO细胞中鉴定PHGDH相互作用蛋白（Figure 3A）。令人兴奋的是，RAF1（MEK/ERK通路的关键激酶）作为高置信度互作蛋白被捕获。后续co-IP实验在多种人源和小鼠细胞（RKO、Hs578T、MC38、CT26）中均验证了内源性PHGDH与RAF1的相互作用（Figure 3C-3D）。通过构建RAF1截短体，发现PHGDH结合在RAF1的N端调控结构域（RD，氨基酸1-284），且该区域也是14-3-3蛋白结合RAF1的关键区域（Figure 3E）。同时，体外GST pull-down证实二者直接结合（Figure 3G）。这个发现立刻点燃了下一个科学问题：PHGDH结合RAF1之后，是否激活了RAF1-MEK-ERK这条经典的PD-L1上调通路？

信号轴验证：PHGDH激活RAF1→MEK/ERK→PD-L1

接下来，研究者检测了PHGDH对RAF1-MEK/ERK通路活性的影响。PHGDH KO显著降低了RAF1 Ser338磷酸化（活化标志）、以及下游p-MEK1/2和p-ERK1/2水平，但总蛋白水平不变（Figure 4A, S4）；相反，过表达PHGDH则增强这些磷酸化水平（Figure 4B）。为了明确RAF1是否介导PHGDH对PD-L1的调控，他们用shRNA敲低RAF1，发现RAF1缺失几乎完全消除了PHGDH KO引起的PD-L1下调，也消除了PHGDH过表达引起的PD-L1上调（Figure 4C, S6A-D）。利用MEK抑制剂（U0126、PD98059）或ERK抑制剂（SCH772984、LY3214996）处理，同样阻断了PHGDH对PD-L1的诱导作用（Figure 4D-4E, S7A-H）。至此一条清晰的信号轴浮出水面：PHGDH通过RAF1激活MEK/ERK，进而上调PD-L1。

上游调控新视角：PHGDH如何激活RAF1？

RAF1的激活通常需要解除14-3-3蛋白的抑制性结合。由于PHGDH与RAF1的结合区域恰好与14-3-3结合区重合，作者猜测PHGDH可能通过与14-3-3竞争性结合来激活RAF1。Co-IP实验显示，PHGDH过表达显著破坏了RAF1与14-3-3ζ或14-3-3γ的相互作用（Figure 5A-5B）；而PHGDH KO则增强RAF1-14-3-3的结合（Figure 5C）。当用siRNA同时敲低多个14-3-3亚型（模拟解除抑制）后，PHGDH KO不再降低PD-L1表达，PHGDH过表达也不再能上调PD-L1（Figure 5D-5G）。这说明PHGDH通过破坏RAF1-14-3-3复合物，释放RAF1活性，进而激活MEK/ERK-PD-L1轴。研究者还发现，PAK2是RAF1上游激酶，PHGDH可促进RAF1与PAK2的结合，进一步增强RAF1活化（Figure S10-11）。

体内功能确证：RAF1-PD-L1轴是PHGDH促瘤的关键效应器

研究者在MC38和CT26同种移植瘤模型中，分别敲除PHGDH、RAF1或PD-L1。结果显示，单独敲除三者均抑制肿瘤生长，但双敲除（PHGDH&RAF1或PHGDH&PD-L1）并未产生叠加效应，提示三者处于同一条通路（Figure 4F-4G）。利用NCT-503抑制PHGDH酶活性可部分抑制肿瘤生长，但当联合敲除RAF1或PD-L1时，NCT-503几乎完全消除了PHGDH驱动的促瘤作用（Figure 4H-4I）。这一结果清晰表明：PHGDH通过酶活性依赖的代谢支持和RAF1-PD-L1免疫逃逸两条平行机制共同促进肿瘤进展，而RAF1-PD-L1轴是其非经典功能的核心。

免疫治疗意义：PHGDH高表达是PD-1/PD-L1阻断的“敏感标签”

既然PHGDH驱动PD-L1表达，那么高表达PHGDH的肿瘤是否对免疫检查点阻断更敏感？在MC38和CT26模型中，与对照肿瘤相比，PHGDH KO肿瘤对抗PD-1治疗的反应性明显降低：肿瘤缩小幅度和生存获益均大幅减弱（Figure 6A-6E）。流式分析显示，PHGDH KO肿瘤中CD8⁺ T细胞浸润和效应分子表达增高，但抗PD-1治疗进一步提升的幅度有限（Figure 6C, 6E）。这表明PHGDH通过上调PD-L1构建了“免疫屏障”，而高PHGDH状态的肿瘤为抗PD-1治疗提供了明确的作用靶点。

联合治疗策略：抑制酶活性+免疫阻断协同增效

基于以上发现，研究者提出假设：联合PHGDH酶活性抑制剂（剥夺代谢支持）与抗PD-1抗体（解除免疫抑制）可能产生协同抗肿瘤效应。在MC38和CT26荷瘤小鼠中，分别给予NCT-503或抗PD-1单药治疗均表现出部分疗效，而两者联合治疗显著抑制肿瘤生长，并大幅延长小鼠生存期（Figure 6G-6H）。重要的是，在PD-L1敲除的肿瘤中，抗PD-1治疗不再有效，且联合治疗也未能进一步增效，表明PD-L1是该联合策略的关键下游靶点（Figure 6I-6J）。动物体重无明显变化，提示治疗耐受性良好。这些结果为PHGDH高表达肿瘤提供了“代谢阻断+免疫激活”的双重打击新策略。

临床相关性：PHGDH与PD-L1、MEK/ERK活化及CD8⁺ T细胞浸润密切相关

为了将基础发现推向临床，研究者利用组织芯片对结直肠癌和乳腺癌标本进行免疫组化染色。结果显示，PHGDH高表达与PD-L1、p-MEK、p-ERK水平呈显著正相关，而与CD8⁺ T细胞浸润呈负相关（Figure 7A-7B）。公共数据库分析也证实PHGDH mRNA与PD-L1 mRNA在肿瘤组织中正相关（Figure 7C）。更重要的是，利用TIDE数据库分析接受抗PD-L1联合治疗患者的RNA-seq数据，发现治疗响应组中PHGDH表达显著高于无响应组（Figure 7D）。这一系列数据完美呼应了前期的机制与动物实验结果，表明PHGDH不仅是PD-L1的关键调控者，还可能成为预测免疫治疗疗效的生物标志物。