Nat. Nanotechnol.|用于减轻肠道炎症和微生物群生态失调的具有消化酶的长双歧杆菌益生菌

大家好，今天推送的文章是2023年3月发表在 nature nanotechnology 上的“Artificial-enzymes-armed Bifidobacterium longum probiotics for alleviating intestinal inflammation and microbiota dysbiosis”。

炎症性肠病可由肠粘膜屏障功能障碍和肠道微生物群失调引起。传统的治疗方法使用药物来控制炎症，可能的益生菌疗法作为辅助治疗。然而，目前的标准做法往往遭受代谢不稳定，有限的靶向，并导致不令人满意的治疗结果。在这里，我们报告人工酶修饰的长双歧杆菌益生菌重塑炎症性肠病的健康免疫系统。益生菌可以促进生物相容性人工酶的靶向和保留，以持续抑制活性氧升高，减轻炎症因子。人工酶引起的炎症减少可提高细菌活力，以快速重塑肠道屏障功能并恢复肠道微生物群。在小鼠和犬模型中证实了治疗效果，并显示出优于传统临床药物的结果。

BL@ B-SA 50的设计和表征

铁单原子催化剂（Fe SA）首先通过金属有机骨架包封的Fe前体（Fe@MOF）的热解制备（图1a）。所得Fe SA显示出平均尺寸为168 nm的菱形十二面体形状（图1c）。Fe元素以原子分散的形式而不是纳米颗粒的形式存在（图1d-f和补充图2c、d和3a）。同时，拉曼和XPS表征表明Fe原子可能与N配位并由石墨碳支撑。通过精细结构的X射线吸收进一步揭示了配位环境。显然，Fe SA在FeO和Fe 2 O3之间的吸收边（图1g）揭示了Fe原子的化学价在+2（FeO）和+3（Fe 2 O3）之间。在1.45 nm处的峰归属于Fe-N（O）配位而不是Fe-Fe配位（2.20 nm）（图1h），证实Fe原子分散在整个Fe SA中。通过扩展的X射线吸收精细结构拟合数据（图1 i、j）定量验证原子Fe位点为N（O）物质的五配位，通过电感耦合等离子体质谱法测定Fe原子负载量为1.31 wt%。

受快速和容易的基于硼酸邻二醇的点击反应的启发，我们选择硼酸-聚（乙二醇）（C18-PEG-B）的接头来结合厌氧BL和Fe SA（图1a）。通过用C18-PEG-B官能化Fe SA，最初制造了模糊SA，并证明了增强的胶体稳定性（图1 k、l）。最后，通过简单地将不同比例的B-SA与BL混合，可以构建BL@B-SAx的益生菌-人工酶系统（图1 m、n）。其中，BL@ B-SA 50被选择用于体外和体内抗炎评价，因为它们在随后的研究中具有最佳的细菌保护效果（图2g）和抗IBD潜力。它们可以直接使用或储存在含有稳定性强的培养基的厌氧管中。

BL@ B-SA 50的ROS清除能力

首先监测B-SA对O2 ·-、H2 O2和·OH（IBD中涉及的代表性ROS）的ROS清除能力（图2a-c）。B-SA通过催化O2 ·-还原为H2 O2和O2而具有突出的SOD样活性。产生的H2 O2可以通过B-SA的CAT样性质进一步消除，表现为产生的O2（图2b）和还原的H2 O2。此外，通过氧化还原反应可以有效地清除·OH，这通过·OH探针的信号强度降低得到证实（图2c）。总的来说，B-SA显示出强大的ROS清除能力，优于其他报道的抗氧化剂。随后，装备这些抗氧化剂B-SA外壳显著提高了BL的ROS清除活性（图2d-f），并确保了它们在苛刻的氧化微环境中的耐受性（图2g）。同时，用B-SA工程化可以在正常或炎症环境中维持BL的生长（图2 h，i）。

在验证了鲁棒BL@ B-SA 50的ROS清除能力之后，通过使用HT 29细胞系作为模型进一步研究了它们的体外抗氧化潜力。有趣的是，BL可以促进HT 29细胞的生长，这可能归因于BL分泌的生物活性因子31（图2 j），有望修复肠粘膜组织。此后，当暴露于炎性微环境时，B-SA、BL+B-SA和BL@ B-SA 50显著改善了HT 29细胞的存活力（图2k），证实了B-SA组分的细胞保护能力。此外，流式细胞术和荧光显微镜证实，抗氧化机制源自ROS清除能力（图2l、m）。此外，由于BL胞外多糖的抗氧化活性，BL处理组的活力也得到增强（图2k）。

BL@ B-SA 50在GIT中的稳定性

在到达发炎的结肠之前，BL@ B-SA 50可能会在口服后遭受恶劣的胃肠道（GI）环境，如胃酸、胆汁盐和炎症，这会使人工酶不稳定，甚至使细菌失活。由于溶液可以首先在20分钟左右快速离开胃，然后通过小肠至少2小时并最终到达发炎的结肠，我们评估了BL和BL@ B-SA 50在模拟胃液（SGF）中孵育10或20分钟后的ROS清除能力和活力，模拟肠液（SIF）和模拟炎性结肠液（SICF）作用。幸运的是，BL@ B-SA 50的ROS清除能力在SGF、SIF和SICF中对于指定的时间点保持一致，并且明显高于BL（图3a-c），表明BL@ B-SA 50的非凡稳定性。同时，用B-SA武装改善了BL在SICF中的存活，而不损害其在SGF和SIF中的耐受性（图3d-f）。更重要的是，BL@ B-SA 50在SICF中表现出稳健的稳定性，有望在发炎的结肠中发挥长期抗炎和微生物群调节功能。

BL@ B-SA 50在炎症肠道中的靶向和长期驻留

此后，通过光声（PA）成像可视化由益生菌引起的增强的肠靶向，因为B-SA在近红外区域中显示出宽吸收并提供强PA对比。当口服给予等量的B-SA和BL@ B-SA 50时，在BL@ B-SA 50治疗的结肠炎小鼠中检测到更强的PA信号（图3g，h），表明BL可以促进B-SA在葡聚糖硫酸钠（DSS）发炎的肠中的积累。BL的这种递送能力也使用其他荧光纳米材料通过体内成像系统进行了验证。此外，受益于增强的靶向，B-SA明显改善了BL在发炎结肠中的存活。

为了有效恢复肠道屏障功能和肠道菌群，BL@ B-SA 50的长期肠道驻留和复制是先决条件。正如预期的，对结肠组织切片的荧光原位杂交（FISH）分析证实BL存在并且主要定位于结肠组织中的粘液层（图3 i）。同时，定量聚合酶链反应qPCR分析显示，BL@ B-SA 50组中的BL数量明显高于BL组中的BL数量（图3 j），这可能归因于B-SA对发炎结肠中的BL的保护作用。

BL@ B-SA 50的体内毒性

为了确保安全的生物应用，系统地评价了BL@ B-SA 50的体内毒理学。健康小鼠每天口服给予或不给予BL@ B-SA 50，持续28天。随后，他们的生物化学并分析血液学参数、体重变化以及主要器官的苏木精和伊红（H&E）染色。BL@ B-SA 50处理组和对照组之间没有明显差异，表明BL@ B-SA 50的毒性可忽略不计。

BL@ B-SA 50对UC的疗效

DSS对基底隐窝的肠上皮细胞直接有毒，并影响粘膜屏障的完整性;因此，提供了小鼠3%（w/v）DSS饮用水连续四天诱导结肠炎。然后，UC小鼠连续口服施用具有可变剂量的不同BL@B-SAx制剂四天以筛选最佳治疗候选物。显然，1.25 mg kg-1 BL@ B-SA 50对结肠炎具有稳健的治疗作用，因此选择其用于进一步研究。此后，根据图4a中所示的方案评估BL@ B-SA 50对其它治疗的功效。经口灌胃后，BL@ B-SA 50可显著干扰体重减轻、疾病活动指数(DAI)结果表明，其他制剂显示出结肠炎小鼠的抗IBD增加、结肠长度缩短和粪便异常，而其他制剂显示出降低的抗IBD结果（图4 b-d）。H& E染色和免疫组织化学（IHC）分析进一步证实BL@ B-SA 50处理可以保护结肠上皮免受病理损伤并抑制IL-6、TNF-α和CD 45的表达（图4 e）。类似地，ROS实验和酶联免疫吸附测定分析也证实BL@ B-SA 50可以降低ROS和促炎因子（包括IL-6、IFN-γ和MPO）的水平，但增加抗炎因子（如IL-10）的表达（图4f、g）。最后，BL@ B-SA 50治疗可以显著提高UC小鼠的存活率（图4 h），而不会触发或加重主要器官中的任何明显的全身毒性体征。总的来说，所有这些结果证明了BL@ B-SA 50用于结肠炎治疗的上级功效，这归因于B-SA和BL在整体中的协同效应。

调节肠道微生物组

为了测试BL@ B-SA 50是否可以缓解肠道微生物群生态失调，我们继续使用V4区域中的16 S核糖体RNA基因测序来研究治疗过程中肠道微生物群的时间动态。明显地，DSS施用促使小鼠微生物群发生深刻且快速的变化，其中生物多样性降低由香农熵降低指示（图5a），并且微生物群组成改变由非度量多维标度图中的分离簇提示（图5 b）。在门水平上的进一步分析发现，DSS显著降低了厚壁菌门的相对丰度，并增加了变形菌门37 -40的相对丰度，这是IBD患者中生态失调的微生物特征。但不同处理后，土壤细菌多样性和群落组成发生了明显变化。特别地，BL@ B-SA 50处理显著地增加了DSS-结肠炎小鼠中厚壁菌门的相对丰度并降低了变形菌门的相对丰度。相反，未处理组进一步加重了IBD中的生态失调（图5a-c）。

在门和科水平上进一步详细公开了治疗后结肠炎小鼠的细菌组成（图5d-k）。显然，BL@ B-SA 50处理显著增加了厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度，包括毛螺菌科（Lachnospiraceae）、胞壁菌科（Muribaculaceae）和乳杆菌科（Lactobacillaceae），其与IBD中的炎症状态呈现负相关。Muribaculaceae丰度与丙酸盐强烈相关，抑制CD 8 + T细胞活化。毛螺菌科与丁酸的产生有关，促进微生物和宿主上皮细胞的生长。此外，BL@ B-SA 50减少了潜在有害的变形菌门的相对丰度，特别是肠杆菌科家族，其可以在发炎的肠道中茁壮成长，以及含有梭杆菌科家族的梭杆菌门，其可以增强IBD中的炎症反应。为了进一步解释观察到的微生物组组成的差异，进行了线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）分析（图5l，m）。与上述结果一致，厚壁菌门的丰度显著降低，IBD相关变形菌门明显富集肠杆菌科（包括志贺氏埃希菌和大肠埃希菌）在对照组结肠炎小鼠中的LDA（log 10）> 4.0，P

对犬UC的有效性

尽管在生物医学研究中广泛使用小鼠模型，但小鼠研究对人类疾病的转化价值仍然存在争议，因为小鼠往往不能充分代表人类状况。特别是，抗IL-17/IL-13/IL-10候选药物在最近的IBD临床试验中无效，表明小鼠模型的局限性。因此，大型动物模型对于验证药物的治疗效果非常重要。在大型动物模型中，狗通常是转化胃肠道研究的最佳代表，因为它们与人类相似的胃肠道生理学，饮食，肠道微生物群和自发性类似疾病。因此，我们进一步评估了BL@ B-SA 50在犬UC模型中的功效。犬UC模型是通过向比格犬的结肠腔注射7%醋酸来配制的，醋酸会损伤肠道并导致炎症因子的产生（图6a），类似于人类结肠炎的传播和炎症类型。1天后，内窥镜检查显示醋酸处理犬的结肠有明显出血和切口（图6 b）。然而，口服BL@ B-SA 50显著促进了受损结肠的愈合（图6c，d），并最终促使白色血细胞水平恢复正常（图6 B）。同时，H&E分析揭示了未治疗的狗的严重炎症，包括固有层中的炎性细胞浸润、腺体破坏和杯状细胞耗竭（图6 e）。在用BL@ B-SA 50处理后，炎症反应减少，这通过IHC染色（图6 e）和ImageJ定量（图6 f）在视觉上进一步证实。总体而言，结果表明BL@ B-SA 50对犬IBD有效，有望用于人类。在治疗期间，犬的体重变化和H& E染色的主要器官和消化道的差异可忽略不计，表明治疗的安全性以及这种BL@ B-SA 50配方适用于大型动物和人类的事实。

炎症的快速缓解和肠道菌群的平衡是治疗IBD的关键。然而，包括抗炎药和益生菌在内的常规疗法的结果不令人满意，并且存在潜在的危险，极大地降低了患者的生活质量，并且增加了患更严重疾病的风险，例如结肠癌。本研究通过构建含抗氧化人工酶的BL益生菌，快速有效地调控IBD的微环境。在该系统中，人工酶被用来模拟天然抗氧化防御系统，以取代临床上使用的抗炎药物。它们清除ROS以减少炎症，具有持续级联催化和生物安全性优于临床药物的优势。反过来，减轻的炎症环境提高了细菌的活力，以迅速重塑肠道屏障功能和肠道菌群。此外，得益于BL益生菌固有的定殖能力，纳米材料的保留时间延长。因此，在DSS诱导的UC中，BL@ B-SA 50明显抑制了ROS和炎症水平，恢复了受损的肠屏障并调节了肠道微生物组。其治疗潜力优于临床上使用的其他传统IBD疗法。此外，BL@ B-SA 50可有效缓解TNBS触发的CD（另一种类型的IBD）和比格犬乙酸引起的UC的症状，这与人结肠炎的传播和炎症类型相似，进一步有望实现其临床转化。治疗中无不良事件发生在重复BL@ B-SA 50处理后的小鼠和狗中。这些结果共同强调了BL@ B-SA 50作为治疗剂的强大潜力，并支持针对不同类型IBD的进一步临床评价。最近，将抗氧化天然酶递送到炎症部位已经显示出对IBD的巨大治疗潜力。特别是，合成生物学已被开发用于遗传修饰益生菌，以产生抗氧化酶，从而在IBD 中抑制H2 O2和O2 ·-。然而，过表达的CAT和SOD仅在它们通过裂解被细菌分泌之前是可用的，从而降低了治疗效果。更糟糕的是，这些暴露的天然酶相当脆弱，当遇到恶劣的GI环境时变得不活跃，无法抑制IBD中复杂和过度活跃的炎症反应。相反，我们的BL@ B-SA 50组合可以有效地缓解IBD。首先，它们可以直接减少炎症而不溶解细菌，因为抗氧化剂B-SA分布在BL表面周围。第二，它们有效地响应复杂的IBD环境，这源于它们强大的多种ROS清除活性。或者，补充抗氧化剂纳米酶（具有酶样活性的纳米材料）也已被提出作为替代IBD的天然酶和传统药物的抗炎方法。然而，纳米酶在消化道中的弱催化能力和快速代谢降低了纳米酶缓解肠道炎症的可行性。此外，它们对ROS以外的其他重要因素的影响，如肠道微生物群之间的平衡以及大型动物的临床转化潜力尚未得到充分研究。为了填补这些空白，我们引入了B-SA的高活性SAzyme以快速降解ROS和益生菌BL载体以延长保留时间，从而大大增加了治疗潜力。最终，证实了它们的微生物群调节性能和翻译价值，上级优于其他报道的纳米酶。除了探索新兴的抗氧化剂候选物外，治疗性益生菌的开发也是IBD治疗的主要领域。先前的尝试集中于通过物理涂层递送益生菌以抵抗胃肠道（GIT）中H+、蛋白酶和抗生素的攻击。虽然有希望，但由于缺乏CAT和SOD，发炎肠道中活性过高的ROS对厌氧菌的代谢是有害的。解决这种对氧化应激的固有脆弱性将加强益生菌的临床IBD治疗。为此，我们将益生菌与人工抗氧化防御系统相结合，可以持续、稳健地高效抑制多种ROS，从而增强BL@ B-SA 50平台的临床可移植性。总之，这项工作中描述的工程化BL益生菌可以代表催化人工酶和代谢益生菌应用于开发抗炎益生菌以减少促炎分子并调节微生物群的生态失调的一个进步。